|
|
Produkce rekombinantního IL-2 imunocytokinu nového typu
Bednaříková, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Interleukin 2 je glykoprotein, který se u člověka skládá ze 133 aminokyselin a je produkován pomocnými T buňkami pro zesílení imunitních reakcí. IL-2 má mnoho imunostimulačních a imunoregulačních funkcí a bylo prokázáno, že aktivuje cytotoxickou funkci přirozených zabíječských buněk, T lymfocytů a monocytů a podporuje cytotoxicitu těchto efektorových buněk. Pokud je v rámci terapie IL-2 podán ve vyšších dávkách, stimuluje efektorové lymfocyty a brání organismus před patogeny a nádorovými buňkami. Pokud je IL-2 podán v nižších dávkách, tak dochází k stimulaci T regulačních buněk, které inhibují imunitní reakci a tím dochází k udržení autotolerance. Zatímco dosavadní studie ukázaly, že IL-2 je účinný při léčbě malignit, byla také pozorována značná toxicita. V posledních letech byly publikovány studie na základě kterých bylo zjištěno, že pokud je IL-2 kovalentně vázán skrz oligopeptidovou spojku na anti-IL-2 monoklonální protilátky, dojde ke zvýšení jeho biologické aktivity in vivo. Zároveň může tato protilátka stericky bránit vazbě na některé podjednotky IL-2 receptoru a přispět tak k selektivní aktivaci a expanzi přirozeně zabíječských buněk a T efektorových buněk, zatímco T regulační stimulovány nejsou. Při spojení IL-2 s anti-IL-2 protilátkou hraje klíčovou roli délka peptidové spojky, jejíž prodloužení by...
|
|
|
Role N-glykosylace v homooligomerizaci receptoru přirozené cytotoxicity NKp30
Tulpa, Matouš ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
NK buňky hrají klíčovou roli v boji proti buňkám, které byly napadeny virem, prvokem nebo podlehly maligní transformaci. Kromě toho také regulují aktivitu a množství dalších buněk imunitního systému. Cílové buňky rozpoznávají pomocí svých aktivačních a inhibičních receptorů, ze kterých přijímají aktivační a inhibiční signály, na nichž je závislá cytotoxická odpověď NK buňky. Mezi signály panuje dynamická rovnováha, která rozhoduje o životě a smrti cílové buňky. Pokud převáží aktivační signály, bude cílová buňka eliminována. Pokud převáží inhibiční signály, pak cytotoxická odpověď nenastane. Receptor NKp30 patří do superrodiny receptorů podobných imunoglobulinům. Jedná se o důležitý aktivační receptor, který rozpoznává celou řadu ligandů, mezi které patří hemaglutinin viru vakcinie a ektromélie, protein pp65 lidského cytomegaloviru, B7-H6, BAG-6 a galektin-3. Extracelulární doména receptoru NKp30 je za určitých podmínek schopna v roztoku homooligomerizovat. První podmínkou je přítomnost N-glykosylace, druhou podmínkou je přítomnost 15 aminokyselin dlouhé "stalk" domény, která propojuje ligand vázající doménu s transmembránovým α-helixem. Cílem této práce bylo ověřit, které ze třech dostupných míst N-glykosylace receptoru NKp30 je zodpovědné za jeho homooligomerizaci. Dalším cílem byla biofyzikální...
|
|
|
Příprava mutovaných forem proteinu B7-H6
Malá, Viktorie ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
Přirození zabijáci zvaní NK buňky (z angl. Natural Killers) jsou velmi podstatnou součástí imunitního systému. Jsou to tzv. přirození zabíječi, nesou na svém povrchu řadu receptorů. Pro imunitní dohled jsou zásadní dva typy receptorů dle funkce zvané inhibiční a aktivační. Inhibiční receptory zajišťují autotoleranci. Druhým typem jsou aktivační receptory, jejichž aktivace vede ke spuštění cytotoxické odpovědi, případně k zapojení dalších složek imunitního systému (např. makrofágů). Aktivační receptor NKp30 (označovaný také jako NCR3 nebo CD337) je protein z rodiny přirozeně cytotoxických receptorů (NCR, z angl. Natural Cytotoxicity Receptors). Je jedním z hlavních lidských NK-buněčných aktivačních receptorů s potenciálním využitím v cílené protinádorové terapii. Aktivačním ligandem receptoru NKp30 je protein B7-H6, který se běžně nevyskytuje na povrchu zdravých buněk. Vyskytuje se výhradně na buňkách, které jsou výrazně stresované, tedy např. na infikovaných nebo maligně transformovaných buňkách. Nese-li maligně transformovaná buňka na svém povrchu B7-H6, dojde ve většině případů k jejímu rozpoznání a eliminaci takřka ihned při jejím vzniku. Protože však ne všechny nádorové buňky jsou B7- H6 pozitivní, nabízí se možnost jejich zviditelnění pro imunitní systém právě skrz dekoraci proteinem B7-H6....
|
|
|
Rekombinantní exprese receptoru myších NK buněk NKR-P1C
Rudenko, Anastassiya ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
NK buňky (z angl. Natural Killers) představují buňky stojící v první řadě obrany organismu proti různým nebezpečím, jakými jsou například viry nebo rakovinné buňky. NK buňky mají schopnost rozpoznat a zničit nežádoucí buňky několika různými způsoby, které se hodně liší od obranných mechanismů například u T- nebo B-lymfocytů. NK buňky nesou na svém povrchu širokou škálu různých aktivačních a inhibičních receptorů, pomocí kterých dokážou rozlišit zdravé buňky od škodlivých, či infikovaných buněk. NKR-P1 (z angl. natural killer receptor-protein 1) je první objevená rodina NK buněčných receptorů podobných lektinům C-typu, do které patří jak aktivační, tak inhibiční receptory. NKR-P1C je aktivační receptor, který je schopen tvorby homodimerů na povrchu NK buněk. Hlavními ligandy NKR-P1 rodiny receptorů jsou imunoenvasiny myšího cytomegaloviru a jiné molekuly strukturně odlišné od MHC glykoproteinů I. třídy. Tato práce se zabývá rekombinantní expresí receptorového proteinu NKR-P1C. Pomocí plazmidu pUT7 byla systémem PiggiyBac připravena stabilně transfekovaná linie buněk HEK293T nesoucí gen pro expresi extracelulární části NKR-P1C spojenou s Fc fragmentem IgG, které mezi sebou nesou zásahovou sekvenci pro štěpení TEV proteasou. Protein byl purifikován pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a...
|
|
|
Produkce IL2-fúzních protilátek a stanovení jejich biologické aktivity
Frantová, Eliška ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Interleukin 2 je malý cytokin s mnoha důležitými imunitními funkcemi. Uplatňuje se zejména jako růstový faktor T buněk, ale působí také na další imunitní buňky a to především na NK a NK-T buňky. IL-2 ve vyšších dávkách indukuje diferenciaci a proliferaci buněčné populace efektorových a paměťových T buněk, které se vyznačují cytotoxicitou a jsou schopny účinné obrany organismu před patogeny anebo nádorovými buňkami. Naproti tomu IL-2 v nízkých dávkách stimuluje populaci Treg, které tlumí imunitní reakce a pomáhají předcházet autoimunitním onemocněním. V nádorové terapii je však stimulace této buněčné populace nežádoucí. Protože je volný IL-2 ve vysokých dávkách pro organismus toxický, byly již dříve navrženy strategie, pomocí kterých by se biologický efekt IL-2 potencoval. Jako jedna z nejslibnějších se jeví jednořetězcový rekombinantní fúzní konstrukt, kde je IL-2 kovalentně vázán pomocí oligopeptidové spojky na anti-IL-2 monoklonální protilátku (mAb). Na základě poznatků ze studia IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexů by v porovnání s volným IL-2 tento imunocytokin (IC) mohl poskytnout značné terapeutické benefity in vivo, a to především velmi robustní posílení biologické aktivity, selektivní stimulaci konkrétních buněčných populací dle zvolené protilátky a snížení systémové toxicity. Důležitou roli u...
|
|
|
Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T.
Celadová, Petra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
NK buňky hrají důležitou roli v imunitní odpovědi proti nádorovým a virově infikovaným buňkám. Exprimují široké spektrum různých povrchových receptorů, mezi které patří také NKRP1. Jedná se o rodinu C-lektinových receptorů, která zahrnuje receptory jak s inhibiční, tak s aktivační funkcí. Poměrně nedávno byly pro některé molekuly z této rodiny nalezeny ligandy, které patří taktéž do nadrodiny C-lektinových receptorů . Jedná se mj. o potkaní Clr-b, fyziologický ligand pro NKRP1B. Bylo zjištěno, že inhibiční funkce receptorového komplexu NKRP1B-Clr-b může být nabourána proteinem potkaního cytomegaloviru RCTL, virové verze Clr-b, která slouží jako falešný ligand pro NK buňky. Cílem mé diplomové práce bylo klonování a příprava zmíněných C-lektinových receptorů v transientně transfekované HEK293T buněčné linii v suspenzní kultuře. Tento expresní systém umožňuje získat proteiny s uspokojivým výsledkem, a to v jejich nativní konformaci, čímž je odstraněna potřeba časově náročných a často bezvýsledných pokusů o renaturaci proteinů připravených pomocí bakteriálního expresního systému v E. coli. Úspěchu bylo dosaženo v případě Clr-b a NKRP1B receptorů potkaních kmenů WAG i SD. Proteiny byly purifikovány za pomoci chelatační chromatografie následované gelovou filtrací, identifikovány hmotnostní spektrometrií a...
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
Příprava myšího interleukinu 2 spojeného s monoklonální protilátkou S4B6
Rožová, Dominika ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Interleukin 2 je růstový faktor T buněk, ale i dalších lymfocytů, jako jsou NK, NKT buňky, dendritické a žírné buňky, které zajišťují jeho expresi a sekreci. IL-2 reguluje homeostázu imunitních buněk a používá se k léčbě řady poruch včetně rakoviny a autoimunitních chorob. V posledních letech bylo popsáno několik případů, kdy komplex interleukinu 2 s protilátkou anti-IL2 vykazoval mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu in vivo. Tyto komplexy mají selektivní stimulační aktivitu pro různé receptory cílových buněk. Tato práce navazuje na předchozí neúspěšné pokusy o expresi a purifikaci dostatečného množství imunokomplexu myšího IL2 s protilátkou S4B6 spojenou 15 aminokyselinovou glycin-serinovou spojkou. V rámci této práce byl připraven plazmid obsahující gen pro fúzní sekretovaný imunokomplex mIL2-S4B6, kterým byla následně stabilně transfekována buněčná linie HEK293T pomocí systému piggyBac. Protein byl následně izolován chelatační afinitní chromatografií a purifikován gelovou permeační chromatografií.
|
|
| |
|
|
Příprava myšího interleukinu 2 spojeného s monoklonální protilátkou S4B6
Rožová, Dominika ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Interleukin 2 je růstový faktor T buněk, ale i dalších lymfocytů, jako jsou NK, NKT buňky, dendritické a žírné buňky, které zajišťují jeho expresi a sekreci. IL-2 reguluje homeostázu imunitních buněk a používá se k léčbě řady poruch včetně rakoviny a autoimunitních chorob. V posledních letech bylo popsáno několik případů, kdy komplex interleukinu 2 s protilátkou anti-IL2 vykazoval mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu in vivo. Tyto komplexy mají selektivní stimulační aktivitu pro různé receptory cílových buněk. Tato práce navazuje na předchozí neúspěšné pokusy o expresi a purifikaci dostatečného množství imunokomplexu myšího IL2 s protilátkou S4B6 spojenou 15 aminokyselinovou glycin-serinovou spojkou. V rámci této práce byl připraven plazmid obsahující gen pro fúzní sekretovaný imunokomplex mIL2-S4B6, kterým byla následně stabilně transfekována buněčná linie HEK293T pomocí systému piggyBac. Protein byl následně izolován chelatační afinitní chromatografií a purifikován gelovou permeační chromatografií.
|
host ::
RSS.